双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗,通过选取下丘脑-垂体-性腺轴（hypot halamic-pituitary-gonadal axis,HPG）的上游调控基因吻素1（KISS1）和促性腺激素释放激素（GnRH）作为靶标,借助2A肽的自剪切功能,引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程,成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中,酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确。重组质粒转染HeLa细胞,反转录后扩增目的基因结果显示,重组质粒在真核细胞内能够正常转录,保证重组质粒在导入机体后能够正常表达,从而引起特异性免疫反应。将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中,获得可直接口服免疫的活载体疫苗,酶切和测序结果表明,双表达重组质粒成功导入工程菌中。将活菌疫苗在体外连续传代50次,选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究,生长曲线检测结果表明,工程菌在体外连续传代50次的过程中,其生长特性无明显变化,且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致,未因携带质粒发生明显变化;同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因（invA）和毒力基因（crp）,结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性,其减毒特性也无变化。各代菌液质粒酶切验证显示,多次传代并不影响质粒的稳定性,重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能。综上所述,该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性,可直接应用于动物免疫去势的研究。     

不同结构对囊素样肽的免疫活性影响

化学合成单拷贝（BS）、30拷贝串联（KG30）和30拷贝分支结构（MAP）3种不同结构的囊素样肽，通过体外外周血淋巴细胞刺激增殖试验、杂交瘤细胞抗体分泌刺激试验、E-玫瑰花环试验和体内小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、新城疫疫苗免疫应答的测定，比较了其免疫增强活性。结果表明，BS和MAP的活性显著高于KG30，BS体外试验活性优于MAP，而MAP体内试验活性优于KS。结构对囊素的活性有显著影响，以分支结构的囊素增强免疫效果最好。     

饲粮能量和蛋白质水平对滩羊小肠中小肽和氨基酸转运载体mRNA表达量的影响

本试验旨在研究饲粮能量和蛋白质水平对滩羊小肠中小肽和氨基酸转运载体mRNA表达量的影响。选取112只健康、体重相近的滩羊,随机分成4组,每组4个重复,每个重复7只羊。标准水平的饲粮能量和蛋白质水平参考《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004),各组试验滩羊分别饲喂不同能量和蛋白质水平饲粮:0.84×标准水平(Ⅰ组)、0.96×标准水平(Ⅱ组)、1.08×标准水平(Ⅲ组)和1.20×标准水平(Ⅳ组)。试验根据羊体重分2个阶段:29~35 kg和36~40 kg。于每个阶段末,每个重复屠宰1只试验羊,取其小肠组织样,运用实时荧光定量PCR技术,研究小肽转运载体1(Pep T1)、y+型氨基酸转运载体1(CAT1)、兴奋性氨基酸转运载体3(EAAT3)mRNA表达量的变化。结果表明:1)在29~35 kg阶段末,小肠中Pep T1 mRNA的表达量随着饲粮能量和蛋白质水平的提高呈先下降再上升的趋势,Ⅱ组显著低于其他3组(P0.05);Ⅳ组小肠中CAT1 mRNA的表达量显著高于其他3组(P0.05);Ⅲ组小肠中EAAT3mRNA的表达量显著高于其他3组(P0.05)。2)在36~40 kg阶段末,Ⅱ组小肠中Pep T1mRNA的表达量显著高于其他3组(P0.05);Ⅱ组小肠中CAT1 mRNA的表达量显著高于Ⅲ组(P0.05);小肠中EAAT3 mRNA的表达量随着饲粮能量和蛋白质水平的提高呈上升趋势,Ⅲ组和Ⅳ组小肠中EAAT3 mRNA的表达量显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P0.05)。由此可见,饲粮能量和蛋白质水平会影响滩羊小肠中Pep T1、CAT1、EAAT3 mRNA的表达量,使机体对小肽和氨基酸的吸收利用率随之改变,以适应滩羊的生长发育。     

饲料中添加天蚕素抗菌肽对南美白对虾免疫功能、抗病力的影响

本研究以南美白对虾为研究对象,探究饲料中天蚕素抗菌肽的合适添加量。在饲料中依次添加不同浓度水平（0%、1%、2%、3%、4%和5%）的天蚕素抗菌肽,配制为6种配合饲料,用以投喂南美白对虾,饲养周期8周。结果显示：与对照组相比,饲料中添加天蚕抗菌肽对南美白对虾增重率、蛋白质沉积率和特定生长率有显著影响（P＜0.05）,高水平天蚕素抗菌肽会抑制南美白对虾的增重率和特定生长率,南美白对虾的饵料系数显著下降,但对南美白对虾存活率和摄食率无显著影响（P＞0.05）|随着饲料中天蚕素抗菌肽的添加水平不断增加,3%组南美白对虾的ACP、POD和SOD含量达到最大水平,与对照组有明显差异（P＜0.05）|随着饲料中天蚕素抗菌肽的添加水平的不断上升,3%组南美白对虾的淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶含量最高,与对照组存在明显差异（P＜0.05）。结果表明,饲料中添加天蚕素抗菌肽显著提高南美白对虾的增重率和特定生长率,提高南美白对虾的生长发育速度,从而增强机体免疫力,提高南美白对虾的抗病能力。 [关键词]天蚕抗菌肽|南美白对虾|抗病力|免疫功能     

抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用

旨在考察鼠源抗菌肽CRAMP的安全性、稳定性及其在清除铜绿假单胞菌生物被膜中的作用。采用兔血红细胞悬液的溶血性和小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)的细胞毒性考察CRAMP的安全性;采用不同温度、蛋白酶、金属离子和酸碱梯度对CRAMP抗菌活性的影响,考察其稳定性;通过在6孔细胞培养板中构建铜绿假单胞菌(PAO1株)成熟生物被膜,以人源抗菌肽LL-37和3种抗菌药为对照,采用结晶紫染色法检测生物被膜量,平板菌落计数法对生物被膜活菌数进行计数,苯酚-硫酸法结合Folin-酚试剂法检测生物被膜胞外基质含量,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察CRAMP干预PAO1生物被膜形态学的变化。结果显示,CRAMP在所测试浓度下对兔血红细胞溶血率均<2%;在62.5~125 mg·L^-1时对 RAW264.7没有细胞毒性。温度(25~100 ℃)、两种盐离子(Na⁺、K⁺)以及pH为5~10时对CRAMP的抗菌活性没有影响;胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶均不同程度影响了CRAMP的抗菌活性。6孔细胞培养板中,4倍MIC 的CRAMP极显著降低了PAO1生物被膜量(减少率为76.74%,P<0.01),极显著减少了生物被膜中的活菌数量(减少了1.2个CFU·mL^-1,P<0.01),效果优于LL-37和3种抗菌药。CRAMP组的胞外基质显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05)。CLSM结果显示：与对照组相比较,4MIC浓度下,CRAMP组的细菌总荧光强度(PI+SYTO)显著低于空白对照组和LL-37组(P<0.05);与空白对照组相比,CRAMP组和LL-37组的死菌荧光强度/活菌荧光强度比值 (PI/SYTO)均极显著增大(P<0.01)。综上表明,CRAMP具有低溶血性、低细胞毒性,除蛋白酶作用不稳定外,具有较好的稳定性,对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用,且效果优于LL-37,具有良好的药物开发前景。     

苷肽注射液对犬外周血CD 4、CD 8比值的影响

以20只健康犬为研究对象,随机分为四组,每组5只,分别注射苷肽注射液、苷肽注射液和犬五联疫苗、犬五联疫苗、生理盐水,各组犬于注射的第0、2、7、15天采血,检测不同组之间的CD 4＋和CD 8＋比值变化规律。结果表明：苷肽注射液单独应用和与疫苗同时应用,在注射的第2天就可以显著提高CD4＋、CD8＋比值,到第7天时达到最高值。并且发现,注射苷肽注射液同时注射犬五联疫苗组和单独注射苷肽注射液组CD4＋、CD8＋比值显著高于单独注射犬五联疫苗组（P〈0.05）,这说明苷肽注射液具有增强免疫的作用。     

日粮添加抗菌肽制剂对荷斯坦牛乳中体细胞数的影响

选用体况、胎次、泌乳期以及产奶量相近的荷斯坦泌乳奶牛48头,随机等分成对照组和试验组,在试验组日粮添加抗菌肽制剂50g／（头·d）以研究其对牛奶体细胞数的影响。试验结果表明,与对照组相比,日粮添加抗茵肽制剂能极显著地降低牛乳体细胞数75．86％（P〈0．01）,同时提高乳脂率（P〈0．05）,但对乳蛋白率没有影响（P〉0．05）。     

光滑爪蟾抗菌肽的分离纯化和对癌细胞的生长抑制作用

通过凝胶过滤层析及高效液相色谱法,从皮肤分泌物中分离出具有抑菌活性的物质,即光滑爪蟾抗菌肽。以大肠癌细胞为体外实验模型,通过细胞形态学、MTS试验,研究光滑爪蟾抗菌肽对SW480细胞的杀伤和生长抑制作用。结果表明,经过分离纯化,得到较纯的活性物质,即光滑爪蟾抗菌肽。通过细胞形态学观察,光滑爪蟾抗菌肽作用组中,细胞的数量明显减少,细胞明显皱缩,成圆形,细胞间隙增大,死细胞增多。MTS试验表明,光滑爪蟾抗菌肽对SW480的生长抑制作用随着浓度的增加而加强。     

免疫血管活性肠肽调节鸡产蛋和就巢的机理研究

旨在研究免疫血管活性肠肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)和抑制催乳索(Prolactin,PRL)分泌对鸡产蛋和就巢的影响机制.试验1:对18周龄未开产的泰和鸡,分别在试验d1、d28、d56和d84免疫含VIP羧基端15肽片段的VIP-BSA偶联蛋白,观察对产蛋和就巢的影响.试验2:利用刚开产的23周龄粤黄鸡,在试验d1、d23、d48、d73、d98免疫VIP串联四聚体重组蛋白,观察对产蛋和就巢的影响,并在第98天检测卵泡发育和下丘脑、垂体、F1～F3级LYF颗粒层和膜层相关基因的表达.试验1中免疫VIP组在开产后高峰期(d55～d61)的产蛋率显著低于对照组,但高峰后的(d89～d103)产蛋率显著高于对照组,同时免疫VIP组的就巢发生也要迟于对照组.试验2中,VIP免疫组的产蛋率在试验初高于对照组;在d33将光照从12 h延长至16 h后,2组的产蛋率均快速上升;产蛋高峰后,免疫组产蛋率快速下降并在dS0～d105显著低于对照组.免疫VIP重组蛋白也降低了就巢的发生.2组鸡在d98的大黄卵泡、小黄卵泡和大白卵泡的数量无显著差异.免疫VIP重组蛋白并不影响下丘脑Gn-RH-Ⅰ和VIP、垂体LHβ和FSHβ的mRNA水平,但显著降低了垂体PRL的表达,也显著降低了垂体和下丘脑PRLR的表达.在检测的F1～F3卵泡组织中,免疫VIP重组蛋白也显著降低了F1和F3颗粒层的PRLR mRNA水平,降低了F1～F3颗粒层和膜层的LHR表达量,但对P450scc和StAR的表达量没有影响.两试验结果表明,免疫VIP能够降低PRL的表达和分泌,从而抑制产蛋引发的就巢发生,但是免疫VIP在抑制PRL表达分泌后也会抑制卵泡发育和产蛋,这一机制可能是通过影响卵泡组织LHR的表达而实现的.